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HPL… ¿Qué? Lo que necesitas saber de la cromatografía líquida
La cromatografía, descrita por primera vez en 1906 por Mikhail Tswett, se utilizó inicialmente para separar pigmentos vegetales, clorofilas y xantofilas, mediante el empleo de un tubo de vidrio relleno de carbonato de calcio (fase estacionaria) y éter como eluyente (fase móvil). Sin embargo, pasaron alrededor de 20 años sin que esta técnica, que prometía simplificar la separación de mezclas complejas, fuera utilizada.
Hoy en día la cromatografía es una técnica usada para separar una muestra en sus compuestos individuales, esta separación ocurre basada en la afinidad de la muestra con la fase móvil o estacionaria, es decir, un componente que es más atraído por la fase estacionaria migrará por la columna de separación a una velocidad más lenta que un componente que tiene una mayor afinidad por la fase móvil.
El proceso básico de la cromatografía es el siguiente: al inicio del proceso la mezcla de componentes se asienta sobre la columna húmeda, cuando la fase móvil pasa por la columna los dos componentes comienzan a separarse en bandas. A medida que cada componente se eluye de la columna cada uno puede recogerse por separado y analizarse por el método que se prefiera. Si los componentes que se separan están coloreados, se pueden ver sus bandas correspondientes. En el caso de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la presencia de las bandas se detecta mediante otras técnicas de análisis instrumental, como la espectroscopia UV-VIS.
Todas las separaciones cromatográficas, operan bajo el mismo principio básico; cada compuesto interactúa con otras especies químicas de una manera característica., sin embargo, conforme fue evolucionando el tamaño de las columnas y el diámetro de las partículas de relleno se llegó a la técnica que hoy en día se conoce como cromatografía líquida de alta presión (HPLC: high-pressure liquid chromatography), nombre propuesto para distinguir esta nueva tecnología de los métodos clásicos de cromatografía líquida a presión atmosférica.
Fase estacionaria
Suele ser un sólido adsorbente fino; un sólido que es capaz de retener partículas de gas o líquido en su superficie exterior. En sus inicios la columna era similar a una pipeta Pasteur, la salida estrecha de la columna se tapona primero con lana de vidrio para soportar el material de relleno de la columna y evitar que se escape del tubo. A continuación, el sólido adsorbente (normalmente sílice) se empaqueta firmemente en el tubo de vidrio para formar la columna de separación. El empaquetado de la fase estacionaria en la columna de vidrio debe hacerse con cuidado para crear una distribución uniforme del material y minimizar la presencia de burbujas y/o canales de aire dentro de la columna. Para terminar de preparar la columna, el disolvente que se utilizará como fase móvil se hace pasar por la columna seca. Una vez que la columna está correctamente preparada, la muestra a separar se coloca en la parte superior de la columna húmeda.
El material adsorbente puede elegirse en función del tamaño de las partículas y de la actividad del sólido. El grado de actividad del adsorbente es una medida de la atracción del sólido por los solutos en la solución de la muestra. El gel de sílice y la alúmina se encuentran entre los adsorbentes más utilizados, sin embargo, el gel de sílice es menos activo que la alúmina, es decir, es menos propenso a modificarse por un cambio de pH, por lo que puede utilizarse como adsorbente para la mayoría de los componentes en solución.
Fase móvil
La elección adecuada de la fase móvil es importante para mejorar la separación de los componentes de una mezcla desconocida. Este eluyente se elegirá en función de su polaridad, en relación con la muestra y la fase estacionaria. Con una fase estacionaria de fuerte adsorción polar, un disolvente polar utilizado como fase móvil será adsorbido por la fase estacionaria, lo que puede desplazar las moléculas de la muestra en la mezcla y puede hacer que los componentes de la muestra se eluyan rápidamente provocando poca separación. Debido a que el disolvente pasa por una columna de diámetro muy estrecho, cualquier contaminante podría, en el peor de los casos, obstruir la columna o, como mínimo, añadir variabilidad a los tiempos de retención durante diferentes ensayos repetidos. Por lo tanto, el disolvente del HPLC debe mantenerse libre de gases disueltos y de partículas.
La bomba de HPLC impulsa el disolvente y la muestra a través de la columna. Para reducir la variación en la elución, la bomba debe mantener un caudal constante y sin pulsaciones; esto se consigue con las bombas multipistón. La presencia de dos pistones permite controlar el caudal mediante uno de los pistones mientras el otro se recarga. El detector de HPLC, situado en el extremo de la columna registra la presencia de los componentes de la muestra, pero no debe detectar el disolvente. Por esta razón, no existe un detector universal que sirva para todas las separaciones. Un detector común de HPLC es un detector de absorción UV, ya que la mayoría de las moléculas medianas y grandes absorben la radiación UV.
A medida que va mejorando la sensibilidad de los instrumentos, cada vez se vuelven más vitales los solventes de alta pureza para lograr el éxito en el laboratorio. Este tipo de reactivos se les denomina comúnmente como “grado HPLC” esto implica un 99% o más de pureza, asimismo, es recomendable filtrar la muestra para evitar contaminación por partículas. J.T Baker cuenta con los productos de la más alta calidad para procesamiento de muestras por HPLC, en su línea HPLC BAKER ANALYZED tienen disponible un grupo de solventes, sales amortiguadoras y modificadores de fase móvil de alta pureza para utilizarse en separaciones analíticas y preparativas.
Los Reactivos HPLC BAKER ANALYZED están optimizados para todas las aplicaciones de Cromatografía Líquida, estos reactivos altamente caracterizados son manufacturados y probados para asegurar separaciones sin interferencia y una consistencia de lote a lote, por lo que la recalibración o ajustes de instrumentos debido a cambios de lote de solventes se ven minimizados. Los solventes se controlan para contar con una alta pureza y una baja absorción de UV, así como por aspectos de fluorescencia, residuos y agua.
Los grados ChromAR y UltimAR J.T.Baker también son recomendados para aplicaciones HPLC. Continuando con una larga tradición que abarca varias décadas de innovación, pureza y uniformidad, estos solventes representan años de investigación y de excelencia en la fabricación para ayudar a los instrumentos para HPLC actuales a alcanzar resultados óptimos. Los solventes HPLC se fabrican usando proceso de purificación de pasos múltiples para producir solventes confiables, bajas interferencias y libre de picos extraños. Los productos se ensayan de acuerdo con su función en cuanto a pureza, agua, residuo después de la evaporación, así como a absorción de UV y fluorescencia en rangos críticos.
https://media.vwr.com/emdocs/video/Chromatography_Series_5_Correct_Solvent_Usage.m4v
Dentro de la oferta de J.T Baker en productos para HPLC, encontramos los siguientes solventes, ácidos y soluciones amortiguadoras, reactivos de par
iónico:
Solventes J.T. Baker para aplicaciones HPLC | Acetona, Acetona, Bajo Nivel de Agua, Acetonitrilo, Cloroformo, Estabilizado en Hidrocarburo, Cloroformo, Ciclohexano, o-Diclorobenceno, Éter, Anhidro, Acetato de Etilo, n-Heptano, Hexanos (95% n-Hexano), Alcohol Isobutílico, Metanol, Éter tert-Butilo de Metilo, Cloruro de Metileno, Metil Etil Cetona, Pentano, 2-Propanol, Piridina Bajo Nivel de Agua, Tetrahidrofurano, Tetrahidrofurano (Estabilizado), Tetrahidrofurano Bajo Nivel de Agua, Tolueno, 1,2,4-Triclorobenceno, 2,2,4-Trimetilpentano, Agua |
Ácidos y Soluciones Amortiguadoras J.T.Baker | Ácido Acético Glacial, Acetato de Amonio, Carbonato de Amonio, Fosfato de Amonio Monobásico Cristal, Bicarbonato de Sodio Polvo, Ácido Trifluoroacético. |
Reactivos J.T.Baker de Par Iónico | Ácido 1-Heptanosulfónico Sal de Sodio, Ácido 1-Hexanosulfónico Sal de Sodio, Ácido 1-Octanosulfónico, Sal de Sodio, Ácido 1-Pentanosulfónico Sal de Sodio, Sulfato de Hidrógeno de Ttetrabutilamonio (98%), Hidróxido de Tetrabutilamonio Titulación (0.4 M en agua), Hidróxido de Tetrabutilamonio en Agua, Fosfato de Tetrabutilamonio |
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Referencias:
https://phenomenex.blog/2017/12/18/que-es-la-hplc/
