Guía paso a paso para el perfil molecular de tumores para investigadores del cáncer

Las terapias dirigidas y personalizadas son ahora comunes en la práctica clínica, adaptadas a los biomarcadores genéticos o proteicos específicos que subyacen e impulsan el crecimiento tumoral, la metástasis, la resistencia al tratamiento y la recurrencia de un paciente.  

En el mundo de la investigación, una comprensión detallada de los biomarcadores detectados en las diversas etapas del desarrollo del cáncer se puede utilizar para desarrollar nuevos tratamientos, pruebas de diagnóstico y una mejor comprensión de la biología del cáncer.

El perfil molecular del tumor es un método que detecta la presencia de biomarcadores específicos (genes, proteínas u otras moléculas) en el tejido tumoral o en la muestra de sangre.1 Hay una variedad de métodos de perfil molecular tumoral que se utilizan en la investigación del cáncer y la oncología, incluida la hibridación fluorescente in situ (FISH), la inmunohistoquímica (IHC), la PCR y la secuenciación de próxima generación (NGS) de ADN y / o ARN, que pueden descubrir ciertas mutaciones genéticas o cambios moleculares.

A medida que los enfoques basados en PCR y NGS para el perfil tumoral se han vuelto más baratos y el número de alteraciones genéticas asociadas con resultados clínicos específicos ha aumentado, han usurpado técnicas convencionales como IHQ y FISH. Estas técnicas modernas han ganado fuerza en las últimas décadas, ya que permiten un análisis multiplexado de múltiples loci, mientras que los métodos tradicionales se centran en un solo objetivo. Con flujos de trabajo más rápidos, análisis bioinformáticos más sofisticados, bases de datos sólidas disponibles públicamente y bancos de tumores completos, la PCR y la NGS se han convertido en los métodos favoritos para la investigación del cáncer y la medicina de precisión.

Con la PCR y la NGS en el asiento del conductor como las técnicas preferidas para el perfil molecular de tumores, existe una necesidad significativa de kits de extracción de ácidos nucleicos, reactivos y flujos de trabajo simplificados para generar y analizar resultados. Sin embargo, elegir qué plataformas y reactivos son apropiados para una aplicación descendente específica sigue siendo un desafío. Para comprender mejor lo que se necesita para estos flujos de trabajo, veamos cada paso en el proceso de perfil molecular de tumores.

El primer paso en el perfil molecular basado en PCR o NGS es la recolección de muestras. En la investigación del cáncer, la extracción de ADN o ARN de biopsias de tejido o tumores sólidos es estándar. Sin embargo, puede haber varias desventajas al usar estos tipos de muestras: Debido a la naturaleza invasiva de la recolección de muestras, hay muestras limitadas de un solo punto de tiempo disponibles, que proporcionan una sola instantánea para analizar el tumor y evaluar la heterogeneidad del tumor. Además, algunas muestras de tejido pueden estar fijadas en formalina, incrustadas en parafina (FFPE), lo que causa daño a los ácidos nucleicos que puede estar tratando de analizar.

En respuesta a estos desafíos, las biopsias líquidas, que pueden detectar biomarcadores circulantes específicos del tumor en sangre, plasma o suero, han surgido como un tipo de muestra alternativa prometedora y no invasiva para el perfil molecular tumoral. También permiten a los investigadores tomar múltiples muestras a lo largo del tiempo, lo que permite el seguimiento longitudinal de la evolución del cáncer. Se pueden detectar diferentes biomoléculas a partir de estas muestras, incluyendo ADN, ARN, proteínas o metabolitos; sin embargo, el ADN libre de células se usa comúnmente para aplicaciones NGS aguas abajo.  

 

Para el perfil molecular basado en PCR o NGS, la preparación de muestras generalmente implica la extracción de ácidos nucleicos de los tipos de muestra discutidos anteriormente. A medida que la investigación del cáncer ha crecido, el número de protocolos y kits disponibles comercialmente para ADN, ARN o ambos se ha expandido. Existen kits especializados de extracción de ADN y ARN para muestras de FFPE, sangre total y aquellos que pueden aislar específicamente microARN. En última instancia, el método o kit de extracción de ADN / ARN que utilice será informado por su tipo de muestra, la aplicación posterior y la pregunta biológica básica que está tratando de responder.

Otra consideración para su extracción de ADN o ARN es si este paso se realizará manualmente o utilizando instrumentación automatizada. Existen varias plataformas disponibles comercialmente para la preparación automatizada de muestras, lo que ayuda a brindar consistencia, seguridad y muchos otros beneficios al proceso general de extracción de muestras.

El ADN o ARN aislado se puede utilizar para varias técnicas de perfil molecular. La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) ha sido durante mucho tiempo una de las favoritas entre los investigadores del cáncer como una técnica rápida, altamente sensible y específica para la detección de mutaciones multiplexadas y el análisis de la expresión génica. Aunque la RT-PCR todavía tiene su lugar, muchos investigadores también emplean plataformas de PCR digital (dPCR).

 

La dPCR no tiene las capacidades multiplex de la RT-PCR, pero proporciona una cuantificación absoluta sensible y específica de una mutación genómica o transcripción sin la necesidad de curvas estándar o normalización, comúnmente utilizadas en los protocolos de RT-PCR. Y con la creciente aplicación en la investigación del cáncer, tanto para biopsias líquidas como de tejidos, hay muchas plataformas y reactivos disponibles para la dPCR.

NGS es otra técnica molecular que proporciona varias ventajas sobre los métodos basados en PCR, a saber, la capacidad de detectar una gama de diferentes aberraciones genómicas o transcriptómicas, incluidas mutaciones, variaciones en el número de copias (CNV), translocaciones del genoma, fusiones de genes y variantes alternativas de empalme. En la investigación del cáncer, la secuenciación del exoma completo (WES) o la secuenciación del genoma completo (WGS) proporciona una gran cantidad de datos, un beneficio significativo para los estudios exploratorios centrados en promover nuestra comprensión de la biología del cáncer.

NGS también se puede utilizar para analizar paneles de genes específicos, que pueden incluir decenas a cientos de genes. Estos se usan más comúnmente en entornos clínicos, ya que ofrecen una mayor cobertura en regiones específicas, resultados más rápidos y datos más relevantes que los métodos WES o WGS.

Una consideración final para los enfoques NGS es si se debe o no utilizar instrumentación automatizada para la preparación de la biblioteca. Las plataformas NGS se han disparado en la última década, y ha habido un gran aumento en el número de plataformas que traen una opción de preparación de bibliotecas automatizada y, por lo tanto, más consistente y rentable a los flujos de trabajo manuales.

El paso final en la mayoría de los flujos de trabajo de perfiles moleculares es analizar las salidas de datos de sus ensayos basados en PCR o NGS. Para RT-PCR o dPCR, la mayoría de los instrumentos proporcionarán software personalizado que puede ayudar a transformar los datos sin procesar en una figura lista para su publicación.

Hay más opciones para los datos NGS: si su equipo incluye un bioinformático experto que puede crear y ejecutar una canalización de análisis de datos, puede procesar y visualizar rápidamente sus datos. Hay muchas herramientas y bases de datos de acceso abierto para elegir, y lo que emplee dependerá en gran medida de su técnica o plataforma de secuenciación. Al igual que los métodos basados en PCR anteriores, las plataformas comerciales tendrán sus propios paquetes de software para ayudar a que la visualización de los resultados sea más ágil y sencilla para aquellos investigadores que no son expertos en bioinformática.

 

Thermo Fisher Scientific ofrece un conjunto completo de soluciones de perfiles moleculares para investigadores del cáncer que analizan biopsias líquidas y muestras de tumores sólidos. Nuestros kits basados en perlas magnéticas y columnas de centrifugado de sílice pueden acomodar una amplia gama de tipos de muestras, incluidas muestras de tejido FFPE, plasma, sangre y suero en formatos compatibles con la automatización. Además, nuestros probados instrumentos RT-PCR, dPCR y NGS proporcionan ensayos sensibles y precisos que le brindan la profundidad de los datos necesarios para ayudarlo a impulsar su investigación.

 

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